국립대학법인 구마모토 대학
국립연구개발법인 일본의료 연구개발기구

• 신장의 여과막을 구성하는 네프린의 변이를 가진 선천선 신증후군 환자의 피부에서 iPS세포를 확보
• 환자로부터 얻어낸 iPS세포에서 유도한 신장조직에서 네프린의 세포표면으로의 이행과 여과막의 형성에 문제가 일어나는것을 관찰할 수 있었다. 즉, 선천선 신장질환의 초기병태를 iPS세포로 재현하는것에 성공
• 이 문제는 네프린의 변이를 수복함에 따라 정상화되었다. 따라서 이 변이가 질환을 일으키는 원인이며 변이를 치료함으로서 원인이 되는 질병의 치료 가능성을 시사했다.

쿠마모토 대학 연구소의 西中村隆一教 (니시나카무라 류이치) 교수의 연구그룹은 선천성 신장질환환자의 iPS세포에서 신장조직을 유도함으로서 병태의 재현에 성공했습니다.

신장은 혈액중의 노폐물을 여과하여 배출하는 장기로 여과로 인해 혈액중의 단백질은 소변으로 새어나오지 않게됩니다.(그림1). 이를 관장하는 것이 사구체의 포도사이트 (podocyte: 사구체상피세포)에 존재하는 여과막 (슬릿막)으로 네프린이라는 물질이 주요 구성요소입니다. 때문에 네프린에 유전자 변이가 일어나면 혈액중의 단백질이 소변으로 대량 배출되어 선천성 네프로제 증후군을 일으키게됩니다. 근본적인 치료는 곤란하며 여과막을 인공적으로 재현하는 방법이 전무하여 연구진행이 어려웠습니다.

니시나카무라 류이치 교수의 연구그룹은 2014년 사람의 iPS세포로부터 신장조직을 시험관내에서 유도하는것에 성공하였습니다. 더욱이 2016년에는 iPS세포로부터 유도한 사구체 포도사이트가 네프린을 발현한것과 유도중 마우스 이식을 하면 포도사이트가 더욱 성숙해지는것을 증명하였습니다. 그렇기에 이번 谷川俊祐(타니가와 슌스케) 조교, Mazharul Islam (마지할) 대학원생과 함께 이 방법을 선천성 신장병의 환자에게 얻어낸 iPS세포에 응용하였습니다.

우선 네프린에 1곳만 변이를 가진 선천성 신증후군 환자의 피부에서 iPS세포를 채취했습니다.(그림 2참조).

그리고 시험관내에서 신장조직을 유도한 결과 본래 사구체 포도사이트의 표면에 존재하게될 네프린이 세포내에 머물뿐 여과막의 전구체(여과막이 생성되기 전의 구성단계)를 거의 만들어 내지 못했음을 알 수 있었습니다. (그림 3 A참조).

유도 도중에 마우스에 이식하면 포도사이트의 성숙이 진행되고, 네프린이 혈관으로 이동하게 되는데 환자에게서 채취한 조직으로는 해당 현상에도 장애가 발견되었습니다.(그림 3 B참조).

즉, 이 선천성 신장질환의 초기 병태를 iPS세포에 의해서 재현한 것이 됩니다.또한 환자에게서 얻어낸 iPS세포로 네프린 변이를 복원하고 신장 조직으로 유도한 결과 상기의 이상은 정상화되었습니다.(그림 4참조).

즉 이 단 1개의 변이가 병을 일으키는 원인이며, 이 변이를 복원함에 의해 치료 가능성을 나타냈습니다.

본 연구는 환자의 iPS세포를 사용하여 사구체성 신장질환의 병태를 재현한 첫 사례이며 질환의 원인 해명과 신약 개발 개발로 이어질 것으로 기대됩니다. 본 연구 성과는 미국 과학 잡지"Stem Cell Reports"온라인 판에 8월 30일 11:00(미국 동부 시간)(일본 시간 8월 31일 0:00 AM]에 게재됩니다.

#본 연구는 구마모토 대학의 江良択実 (에라 타쿠미) 교수와 仲里仁史 (나카자토 히토시)교수, 쥰텐도 대학의 栗原秀剛准(쿠리하라 히데마사) 준교수, 류큐 대학의 中西浩一(나카니시 고이치) 교수, 히로시마 대학의 山本卓教 (야마모토 스구루) 교수의 공동 연구입니다. 문부 과학성 과학 연구 보조금, 일본 의료연구개발기구의 재생의료실현거점 네트워크 프로그램 "질환 특이적 iPS세포를 이용한 유전성 신장질환의 병태 해명" 및 재생의료 실용화 연구사업" 외래인자 개입이 없는 난치병 유래의 iPS세포의 도서관 구축과 그것을 사용한 질환모델과 약제개발"의 지원을 받았습니다.

신부전에 의한 인공투석 환자의 수는 증가 추세로 의료비 증대의 원인이 되고 있지만 신장이식의 기회는 한정되어 있습니다. 한편 신장을 만들어내는것은 매우 어렵지만 쿠마모토 대학 발생의학 연구소의 연구 그룹은 2014년에 인간 iPS세포로부터 시험관내에서 신장 조직의 제작에 성공했습니다. 이는 세계 최초이며 동시에 신장 재생의료의 새로운 문을 열게된 성과였습니다. 또한 2016년에는 iPS세포에서 유도한 사구체의 포도사이트에서 네프린을 강하게 발현하고 있는 것과 포도사이트에 대한 유도의 도중에 마우스에 이식함으로서 인간의 사구체가 마우스의 혈관과 연결되어 포도사이트의 성숙이 진행되는 것을 알아내었습니다. 때문에 이번에는 상기 기술을 환자에게서 유래한 iPS세포에 응용하기로 했습니다.

선천성 신증후군은 생후 3개월내에 대량의 단백뇨를 배출하며 혈액중의 단백질의 저하에 의해 전신부종과 함께 2-3년내에 신부전이 진행되는 경우가 많은 질병입니다.

이 원인의 하나로 네프린 이상이 있습니다.

네프 린은 사구체 포도사이트의 세포 표면에 존재하는 물질로 인접세포 네프린끼리 맞붙어 그물 구조를 형성합니다. 이를 여과막 (정식으로는 슬릿막)이라고 부릅니다만 그물의 구멍이 매우 작기 때문에 혈액중 입자가 큰 단백질은 소변으로 새지 않도록 되어 있습니다 (그림 1참조). 그렇기에 네프린이 결손되는 경우나 단 하나의 아미노산 배열에 이상이 생겨도 여과막의 형성이 불완전하게 되고 결과적으로 단백뇨를 배출하게 된다고 생각되어집니다. 그러나 출산직후 이미 대량의 단백뇨를 배출하기에 이 질병이 태아기의 언제부터 어떻게 발병하는지는 확실히 알 수 없습니다. 또한 인간의 유전자 배열에는 많은 개인 차이가 존재하고 네프린도 예외는 아닙니다. 때문에 환자의 네프린 배열을 해독하고 몇가지의 차이를 발견해도 그 차이가 질병을 일으키는 진짜 원인인지 그리고 그 변이가 어떤 메커니즘으로 병을 일으키는지를 트래킹하기는 어렵습니다. 배양 세포나 마우스를 사용한 연구는 오랫동안 이루어지고 있지만 여과막을 인공적으로 만들어내는 방법이 존재하지않음으로서 연구진전의 걸림돌이 되고 있었습니다. 그래서 이번에는 네프린의 하나의 아미노산에서 변이를 가진 환자으로부터 iPS세포를 채취하여 발병초기의 용태를 재현 혹은 어떤 메커니즘으로 이루어지는지 그 변이가 정말 병의 원인인지, 그렇다면 그 변이의 복원에 의해서 증상이 소실되는지를 검토했습니다.

우선 선천성 신증후군 환자들중 네프린에 변이를 가진 유전자를 찾는 방법을 알아냈습니다. 유전자 서열 분석결과 1곳만 변이가 있으며 이 때문에 아미노산이 1개만 정상과는 다르다는 것을 알아내어 이 환자의 피부세포를 채취하여 iPS세포를 확보했습니다. (그림 2참조).

환자에서 유래한 iPS세포와 정상 iPS세포를 시험관내에서 약 1개월에 걸쳐서 신장조직을 유도했습니다. 정상적인 신장 조직에서는 사구체 포도사이트의 세포 표면에 네프린이 존재하는 세포와 세포사이에 네프린이 집적된 거름막 전구체로 여겨지는 그물상의 구조가 확인되었습니다. 그러나 환자에서 유래한 iPS세포의 신장 조직에서는 네프린은 세포안에 머물고 거름막 전구체도 거의 형성되지 않았습니다.(그림 3 A참조).

iPS세포에서 유도 도중 마우스에 이식하면 정상적으로 네프린이 포도사이트의 혈관에 모여서 선형구조를 구성하게 됩니다 (그림 3 B). 그리고 포도사이트의 세포 돌기가 복잡해지고, 돌기와 돌기의 간격이 펼쳐집니다. 이것이 여과막의 형성 과정을 나타내고 있다고 보여집니다만 환자에서 유래한 것이 네프린은 여전히 세포내에서 진행되지않았습니다. 돌기는 생성되었지만 돌기와 돌기의 간격은 좁고 거름막의 형성은 이루어지지 않았습니다. 따라서 선천성 신증후군 환자의 발병 초기의 용태를 iPS세포를 이용하여 확인할 수 있었습니다.

 뿐만아니라 게놈 편집 기술을 사용하여 환자 iPS세포의 네프린의 변이를 복원하여 신장 조직에 유도한 결과 여과막의  전구체가 부활했습니다(그림 4참조). 또한 마우스에게 이식하면 포도사이트의 돌기의 간격이 생성되며 여과막이 형성되고 있음을 알았습니다. 즉, 이 단 1개의 변이가 병을 일으키는 원인임이 증명되었으며 동시에 이를 복구하는 치료의 가능성도 제시된 연구결과입니다. 본 연구는 환자에게 얻어낸 iPS세포를 사용하고 사구체성 신장병의 병태를 재현한 최초의 예입니다.

선천성 신 증후군의 뱅태가 재현함으로서 이 포도사이트을 사용하여 치료약을 만들어낼 수 있는 가능성이 있습니다. 또 다른 타입의 변이 환자에게 iPS세포를 만들면 각각 병의 메커니즘이 밝혀지면서 그것에 맞는 신약을 만들어낼 수 있는 가능성도 있습니다.

선천성 신증후군은 드문 병이지만 이번 성과의 대상은 선천선 신증후군에만 한정되지 않습니다. 소아기의 신증후군은 물론 성인 신장병이 발병하는 경우도 단백뇨에서 시작하는 것이 많기에 여과막 즉 네프린에 어떤 장애가 생겼을 가능성이 지적되고 있습니다. 네프린의 상태를 제어하는 약이 만들어지면 신장병에 폭넓은 효과를 기대할 수 있는 가능성도 있습니다. 따라서 이번 성과는 포도사이트에 작용하고 단백뇨를 줄이는 신약의 개발을 위한 커다란 전진이라고 할 수 있습니다.

iPS세포：

피부나 혈액 등의 체세포에서 만들어진 만능세포

사구체：

신장내에서 혈액을 바탕으로 소변을 만들어내는 부위

포도사이트：

사구체의 여과기능을 담당하는 세포. 복수의 돌기와 특수한 여과막을 가지고 있음

네프린：

포토사이트의 여과막을 구성하는 주요 단백질

신증후군 (네프로제)：

사구체의 이상으로 인해 혈액중의 단백질이 소변에 섞여 배출되는 질병.

선천적인 경우 생후 3개월이내에 대량의 단백뇨 등의 소변이상소견을 보이며 혈액중의 단백질 저하로 인해 전신부종을 일으킴. 2-3년이내에 신부전에 다다를 가능성이 높음. 네프린의 이상에 의해 선천적 신증후군은 핀란드에서 특히 빈도가 높음 (8,200명중 1명)

Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes
Stem Cell Reports on line  Aug 30, 2018

Shunsuke Tanigawa, Mazharul Islam, Sazia Sharmin, Hidekazu Naganuma, Yasuhiro Yoshimura, Fahim Haque, Takumi Era, Hitoshi Nakazato, Koichi Nakanishi, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Hidetake Kurihara, Atsuhiro Taguchi, and Ryuichi Nishinakamura

쿠마모토 대학 발생학연구소 신장발생분야
교수　西中村 隆一（니시나카무라 류이치）
전화：096-373-6615
E-mail：ryuichi"AT"kumamoto-u.ac.jp

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